Recenti studi hanno mostrato che uno dei meccanismi alla base della tossicità per le cellule tumorali di un alto livello di ascorbato è determinato dall’aumento del ferro labile nel citoplasma, che a sua volta causa un massiccio aumento di specie reattive dell’ossigeno che comporta la successiva morte cellulare per ferroptosi. Il rilascio di ioni ferrosi indotto dall’ascorbato non può essere facilmente controllato dalla cellula. Se il flusso passivo in uscita dell’ascorbato (dipendente dalle proprietà elettriche di membrana) viene per qualche motivo limitato, i suoi livelli intracellulari possono aumentare fino a livelli tossici. L’importante conseguenza del flusso passivo dell’ascorbato attraverso il doppio strato lipidico è che il potenziale elettrico della membrana plasmatica e il pH locale influenzano la concentrazione intracellulare di ascorbato. E questo apre alla possibilità di utilizzare le differenze di potenziale elettrico della membrana plasmatica e/o del pH locale tra cellule sane e tumorali come strumento di selettività terapeutica. Nelle cellule tumorali, a causa di proprietà elettriche della membrana plasmatica particolari e del pH locale, l’ascorbato può aumentare a livelli tali da innescare la ferroptosi.
In questo studio viene presentata un’analisi matematica quantitativa volta a determinare la dipendenza della concentrazione intracellulare (all’interno della cellula) di ascorbato, allo stato stazionario, dalla sua concentrazione nel siero, nonché il tempo necessario per raggiungere il livello di stato stazionario, per le cellule sane e tumorali.
Considerazioni generali alla base del modello presentato
Le terapie basate sull’ascorbato si basano sul presupposto che l’ascorbato influenzi uno specifico processo molecolare nelle cellule cancerose in un modo dipendente dalla concentrazione extracellulare, in linea con il pensiero farmacologico classico. Tuttavia, l’applicazione dell’ascorbato come agente farmacologico è diversa, per la sua dualità funzionale e per i processi di regolazione attivi e passivi della concentrazione di ascorbato nel citoplasma. A seconda della sua concentrazione intracellulare, la sua funzione può variare: dalla funzione di cofattore e antiossidante, al causare la morte cellulare per ferroptosi. L’innesco avviene ad una specifica concentrazione di ascorbato all’interno della cellula. Questa dualità funzionale può essere utilizzata nel trattamento del cancro solo se esiste un meccanismo di selettività per l’acquisizione di ascorbato da parte delle cellule. Nel modello matematico studiato, si è ipotizzato che questa selettività risieda nella membrana plasmatica e nelle sue proprietà elettriche. Quindi la concentrazione intracellulare di ascorbato allo stato stazionario sarà influenzata da proprietà cellulari, quali pH citoplasmatico, ph extracellulare, potenziale elettrico della membrana, numero di trasportatori SVCT2 presenti nella membrana plasmatica e attività metabolica cellulare. Per questi parametri esistono differenze sostanziali tra cellule sane e cellule tumorali. Per l’analisi presentata in questo lavoro sono stati confrontati due modelli di cellule immaginarie, che differiscono per quanto riguarda queste caratteristiche.
Visto che è generalmente accettato che il livello terapeutico efficace possa essere raggiunto solo tramite infusione endovenosa di una grande quantità di ascorbato, uno degli obiettivi della simulazione era determinare se le concentrazioni terapeutiche possono essere raggiunte tramite integrazione orale prolungata con preparazioni tradizionali o liposomiali.
Risultati principali del modello matematico
1) La concentrazione di ascorbato intracellulare allo stato stazionario calcolata nell’intera gamma di parametri utilizzati è significativamente più alta nelle cellule cancerose rispetto alle cellule sane, indicando un alto livello di selettività del trattamento.
2) L’effetto del potenziale elettrico di membrana colpisce le cellule cancerose in misura molto maggiore, indipendentemente dal valore della concentrazione di ascorbato extracellulare.
3) La concentrazione intracellulare di ascorbato allo stato stazionario dipende dal pH intracellulare. Ciò è dovuto al livello di protonazione dell’ascorbato all’interno della cellula che influenza drasticamente la sua perdita passiva. La concentrazione intracellulare di ascorbato allo stato stazionario è molto sensibile alle differenze di pH tra fluidi extracellulari e intracellulari.
4) Il numero di trasportatori SVCT influenza la concentrazione intracellulare di ascorbato allo stato stazionario. Questo numero è controllato epigeneticamente, può influenzare l’effetto del trattamento, specialmente quando il trattamento è prolungato nel tempo. Anche le varianti genetiche dei trasportatori possono influenzare l’esito del trattamento.
5) La risposta epigenetica delle cellule tumorali è molto più forte (aumento maggiore dei trasportatori SVTC) delle cellule sane rispetto alla loro capacità di modulare la loro concentrazione intracellulare di ascorbato.
3) Le simulazioni indicano che non ci sia alcuna differenza tra le vie di somministrazione orale e endovenosa poiché c’è poca differenza tra le concentrazioni intracellulari di ascorbato allo stato stazionario quando la sua concentrazione nel siero è pari a 0,2, 0,5 e 1 mM.
4) Il tempo necessario per raggiungere le concentrazioni intracellulari di ascorbato allo stato stazionario è un parametro critico. Sono presentati tre andamenti temporali per 0,2, 0,5 e 1 mM di concentrazioni extracellulari di ascorbato per mostrare che nel caso del trattamento con ascorbato, la concentrazione sierica non è così importante, ma è invece critico il tempo di esposizione. I risultati ottenuti mostrano che l’effetto terapeutico può essere ottenuto quando la concentrazione sierica di ascorbato è facilitata dall’integrazione utilizzando tutte le vie di somministrazione disponibili, purché il tempo di esposizione sia sufficientemente lungo (giorni, non ore).
Discussione
Nella farmacologia classica, il composto attivo è di origine esogena ed è progettato per raggiungere e influenzare specifici bersagli molecolari. In genere, l’internalizzazione di tale composto da parte di una cellula non è facilitata dalle proteine di membrana, ma piuttosto si diffonde attraverso il doppio strato lipidico. L’efficacia della diffusione passiva dipende principalmente dalla concentrazione del composto attivo nel siero. Questo perché la diffusione passiva necessita di un gradiente di concentrazione attraverso la membrana plasmatica cellulare. Questo processo molto aspecifico è una fonte di tossicità sistemica e la selettività verso le cellule bersaglio si basa sull’affinità preferenziale verso un’entità molecolare attentamente selezionata.
Per quanto riguarda le terapie con ascorbato, il modello presentato nel documento mostra che la concentrazione di ascorbato nel siero non è un buon parametro per progettare una terapia efficace. Questo perché la diffusione passiva non è un meccanismo responsabile dell’ingresso dell’ascorbato nel citoplasma cellulare, come nel caso di tutti i farmaci esogeni. L’anione dell’ascorbato viene attivamente accumulato all’interno della cellula da trasportatori dedicati della membrana plasmatica. Quando i trasportatori sono saturi, a circa 0,1 mM di concentrazione sierica di ascorbato, un ulteriore aumento della sua concentrazione non è produttivo. Considerando la recente scoperta della diffusione passiva dell’ascorbato attraverso i doppi strati lipidici e supponendo che la ferroptosi sia il meccanismo principale dell’attività terapeutica dell’ascorbato, è stato proposto un modello che mostra che la concentrazione sierica dell’ascorbato non è di importanza critica, ma piuttosto la durata del trattamento. La somministrazione di ascorbato per via orale per un tempo sufficientemente lungo dovrebbe dare risultati terapeutici migliori rispetto a un’infusione endovenosa relativamente breve (poche ore) delle sue grandi quantità.
Conclusioni finali
La concentrazione di ascorbato all’interno di una cellula è il risultato di tre processi, degradazione metabolica, trasporto attivo facilitato da trasportatori dedicati (SVCT1 e SVCT2) e diffusione passiva attraverso il doppio strato lipidico della membrana plasmatica. La dipendenza del trasporto passivo dalla protonazione dell’ascorbato e dalla differenza di potenziale della membrana plasmatica possono essere utilizzate per il targeting selettivo dell’ascorbato sulle cellule cancerose. In particolare, la maggior parte delle cellule che costituiscono il corpo umano sono altamente differenziate. Tali cellule sono caratterizzate, tra le altre cose, da un’elevata negatività all’interno del potenziale elettrico della membrana plasmatica (che raggiunge -100 mV). Le cellule tumorali sono diverse, poiché il loro potenziale elettrico della membrana plasmatica è solitamente basso e non supera -10 mV. Questa differenza può essere utilizzata per aumentare la concentrazione di ascorbato nel citoplasma delle cellule tumorali senza influenzare le cellule sane. Questo effetto può giustificare l’applicazione dell’ascorbato come trattamento di supporto nella terapia del cancro caratterizzata da tossicità sistemica nulla o bassa. Le simulazioni presentate nel documento mostrano che tale trattamento per essere efficace richiede il mantenimento di una concentrazione di ascorbato sufficiente, anche se non necessariamente eccessivamente elevata, nel plasma e nei fluidi interstiziali. Tuttavia, a causa della capacità limitata del trasporto attivo, l’esposizione all’ascorbato dovrebbe essere estesa nel tempo per giorni piuttosto che per ore.