I carcinomi e la perdita di differenziazione cellulare epiteliale. I carcinomi sono il tipo di cancro solido più frequente (circa il 90%). Derivano da cellule epiteliali che perdono le loro caratteristiche di cellule differenziate (principalmente polarità apicale-basale e adesività) e il controllo della loro proliferazione. La perdita di differenziazione epiteliale deriva dall’acquisizione di un programma cellulare chiamato transizione epitelio-mesenchimale (EMT). Questa transizione comporta drastici cambiamenti nel modello di espressione genica, innescati da un gruppo di fattori di trascrizione, i fattori di trascrizione attivanti la EMT e indicati con la sigla EMT-TF, che causano la repressione del fenotipo epiteliale e l’induzione di uno stato cellulare mesenchimale. Una cellula mesenchimale, rispetto ad una cellula epiteliale, ha la funzionalità di una cellula connettivale embrionale, acquisisce morfologia fibroblastica con elevata capacità riproduttiva e mobilità, e può differenziarsi in diversi tessuti. I regolatori di polarità cellulare, le diverse proteine di superficie delle cellule epiteliali responsabili dell’adesività cellula-cellula e cellula-substrato, inclusi i componenti delle giunzioni aderenti come l’E-caderina, ed altre, così come i componenti del citoscheletro e altri che legano la cellula alla matrice extracellulare (ECM), vengono sostituite da altre tipiche delle cellule fibroblastiche mobili capaci di invasione della membrana basale. L’EMT fornisce alle cellule tumorali altre caratteristiche di malignità, come staminalità e apoptosi ridotta.
Il processo EMT è attivato da una varietà di agenti e segnali che inducono o attivano fattori di trascrizione tipici legati all’attivazione della EMT (EMT-TF) come il fattore di crescita trasformante (TGF)-β, le proteine Wnt, e altri. Questi segnali di solito agiscono in modo cooperativo e in molti casi sono prodotti dalle cellule stromali del microambiente tumorale. L’EMT è un fenomeno reversibile e solitamente parziale. Non colpisce tutte le cellule di un tumore, genera eterogeneità fenotipica intratumorale. Successivamente, durante la tumorigenesi, l’EMT viene invertito dal processo opposto della transizione mesenchimale-epiteliale (MET). Ripristinando l’aggregazione cellulare e i legami con la matrice extracellulare, MET probabilmente facilita la sopravvivenza delle cellule tumorali durante la circolazione nel flusso sanguigno e la colonizzazione iniziale delle nicchie metastatiche.
Vitamina D3 e differenziazione cellulare nei carcinomi
Morfologia, adesione, blocco della EMT nel cancro al colon. Molti studi sugli effetti di 1,25(OH)₂D₃ sulle cellule del carcinoma sono stati condotti nel cancro del colon e della mammella a causa della loro elevata incidenza e mortalità. Queste due neoplasie sono quelle più comunemente associate alla carenza di vitamina D. Come nella maggior parte dei tipi di cellule tumorali, 1,25(OH)₂D₃ riduce la proliferazione cellulare, la sopravvivenza cellulare per aumento della sensibilità agli stimoli apoptotici, induce la differenziazione cellulare.
L’induzione della differenziazione cellulare consiste nella determinazione di un cambiamento morfologico e aumento dell’adesione cellula-cellula e cellula substrato, e questo effetto è direttamente correlato al livello di espressione del recettore VDR. I dati mostrato che la D₃ sovraregola una serie di molecole di adesione intercellulare, tra cui E-caderina, induce e/o ridistribuisce diverse citocheratine che modulano il citoscheletro di actina e la rete di filamenti intermedi e le strutture di legame dell’ECM. Nelle cellule epiteliali normali la D₃ inibisce l’induzione di EMT da parte del fattore di crescita trasformante β (TGF-β) e da parte dell’interleuchina-1β.
Blocco segnalazione Wnt/β-catenina nel cancro al colon. La dedifferenziazione epiteliale, l’induzione di EMT e l’acquisizione di staminalità è legata all’attivazione di diversi percorsi di segnalazione tra cui il percorso Wnt/β-catenina. Quando questo percorso si attiva, sia per mutazioni (tipiche di molti tumori al colon primari e nelle metastasi) che per stimolazione da parte dei fattori proteici Wnt, la β-catenina, non viene più degradata ma si accumula del nucleo cellulare delle cellule epiteliali del colon e agisce come regolatore trascrizionale, attivando uno specifico programma di espressione genica che coincide in gran parte con quello delle normali cellule staminali intestinali. Ciò porta alla dedifferenziazione epiteliale, all’induzione di EMT e all’acquisizione di staminalità. Pertanto, l’attivazione anomala del percorso Wnt/β-catenina è responsabile dell’inizio e probabilmente anche della progressione del cancro del colon attraverso l’aumento della sopravvivenza e della proliferazione delle cellule epiteliali del colon e la perdita del fenotipo differenziato. È stato dimostrato che la vitamina D antagonizza questo percorso di attivazione, ovvero lo blocca, a diversi livelli sia nelle cellule del cancro al colon ma anche in altri tipi di tumore. Sono stati ipotizzati diversi meccanismi di disattivazione, uno di questi è dovuto all’aumento di E-caderina causato dalla D₃, la quale, grazie alla sua elevata affinità, lega nelle giunzioni di superficie, e così sequestra, la proteina β-catenina citosolica di nuova sintesi.
Ulteriori molecole prodifferenzianti nel cancro al colon.Il lavoro degli autori di questo articolo ha portato all’identificazione di altri mediatori dell’azione di prodifferenziazione della D₃ nelle cellule del carcinoma del colon. Questi mediatori includono cistatina D, miR-22, KDM6B e Sprouty-2 (SPRY2).
La cistatina D è una proteina fortemente indotta dalla D3, che a sua volta induce l’espressione di E-caderina, reprime geni per i fattori che attivano la EMT, blocca il percorso Wnt/β-catenina.
Il microRNA miR-22, indotto da 1,25(OH)₂D₃ è coinvolto nella regolazione sull’espressione genica da parte della D3, inibisce la EMT, l’invasività e crescita tumorale nel cancro del colon e in alcuni altri sistemi tumorali.
KDM6B è un enzima demetilante l’istone H3 (H3K27me2/3), un regolatore epigenetico. I dati indicano che la D₃ sovraregola l’espressione di questo gene KDM6B. KDM6B aumenta la produzione di proteine di adesione cellulare, aumenta l’induzione di E-caderina e la differenziazione cellulare e l’inibizione dell’attività trascrizionale della β-catenina.
SPRY2 è stato scoperto essere un gene fortemente represso da 1,25(OH)₂D₃ e i dati indicano che la sua repressione apporta un contributo importante all’azione di prodifferenziazione di della vitamina D3.
Effetto differenziante della vitamina D nel cancro al seno. Il cancro al seno è una malattia altamente eterogenea. I tumori al seno tripli negativi o TNBC che mancano o esprimono livelli molto bassi di proteine ER (recettore estrogeni), PR (recettore progesterone) e HER2 (recettore fattore di crescita epidermico) hanno la prognosi più sfavorevole. Le cellule ER-PR-HER2- sono altamente dedifferenziate, cioè anaplastiche. I pazienti con TNBC hanno livelli ematici di 25(OH)D molto bassi e alcuni studi in vitro e clinici suggeriscono la possibilità di un effetto protettivo di 1,25(OH)₂D₃ contro il TNBC.
In linee cellulari di carcinoma mammario umano è stato dimostrato che la vitamina D₃ induce un cambiamento specifico nella morfologia delle cellule e nell’espressione genica. Alterare la citoarchitettura dei filamenti di actina e dei microtubuli, induce estensioni citoplasmatiche (filopodi e lamellipodi), aumenta l’adesione cellulare al substrato. L’inibizione da parte di D₃ della migrazione delle cellule del carcinoma mammario, dell’invasione e delle capacità metastatiche secondo alcuni dati avverrebbe tramite una riduzione dell’espressione e/o dell’attività della N-caderina, dei componenti dell’ECM, e delle metalloproteasi (MMP-1, MMP-9). La sovraregolazione della proteina adattatrice del citoscheletro di actina da parte della D3 è fondamentale per le azioni pro-adesive, antimigratorie e anti-invasive di questa vitamina nel carcinoma mammario.
Effetto differenziante della vitamina D in altri tumori solidi. Come nei tumori del colon e del seno, 1,25(OH)₂D₃ induce la differenziazione cellulare, sensibilizza all’apoptosi e inibisce la proliferazione, la migrazione e l’invasione in una serie di altre neoplasie solide. Ancora una volta, i suoi effetti sulla differenziazione sono in gran parte dovuti all’inibizione dell’EMT e all’antagonismo del percorso di segnalazione Wnt/β-catenina, all’inibizione del fattore di crescita trasformante β (TGF-β) e il fattore di crescita dell’epidermide (EGF).
Nelle cellule del carcinoma tiroideo anaplastico, del carcinoma ovarico, dell’adenocarcinoma polmonare e del carcinoma renale è stato descritto l’inibizione del percorso TGF-β, con repressione dei fattori stimolanti la EMT e la sovraregolazione dei marcatori epiteliali da parte della vitamina D₃. Nel complesso, i dati indicano che la 1,25(OH)₂D₃ è un forte promotore multiforme della differenziazione delle cellule del carcinoma umano con associata diminuzione della proliferazione delle cellule del carcinoma, sopravvivenza, capacità migratorie, invasive e metastatiche.
Effetto differenziante della vitamina D nei tumori ematologici. Come nei tumori solidi, la carenza di vitamina D è comune tra i pazienti con neoplasie ematologiche. La D₃ e analoghi sintetici inibiscono la proliferazione delle cellule di leucemia, linfoma e mieloma, oltre a favorire la loro apoptosi. Un effetto ampiamente riportato di D₃ in queste cellule è l’inibizione della segnalazione STAT-1 e STAT-3 e successiva repressione di un gran numero di citochine. 1,25(OH)₂D₃ induce la differenziazione delle cellule della leucemia mieloide e sono stati riportati effetti di prodifferenziazione anche in colture di cellule del linfoma non-Hodgkin follicolare.
Vitamina D3 e differenziazione nei fibroblasti stromali tumorali. Oggi ampiamente accettata l’importanza cruciale del microambiente tumorale in tutte le fasi della carcinogenesi ma sono scarsi gli studi sull’azione di 1,25(OH)₂D₃ sulle cellule stromali tumorali. I fibroblasti associati al cancro (CAF) sono il tipo di cellula più abbondante nel microambiente tumorale. I CAF sono una popolazione eterogenea di cellule generate da origini diverse in risposta a segnali secreti dalle cellule tumorali o da altre cellule dello stroma tumorale. Di solito, ma non sempre, i CAF hanno effetti promotori del tumore che favoriscono la malignità, alterano la matrice extracellulare, secernono fattori protumorigenici e di resistenza ai farmaci. Studi sull’espressione genica di fibroblasti associati al cancro umani isolati da biopsie e in fibroblasti sani mostrano una firma genetica della D3 che riflette un effetto antiproliferativo e antinfiammatorio La 1,25(OH)₂D₃ promuove una profonda riprogrammazione del profilo di espressione genica dei CAF, che porta all’inibizione del loro fenotipo protumorale. L’analisi delle biopsie tumorali ha mostrato che un’elevata espressione di VDR nei CAF è associata a una migliore sopravvivenza complessiva e libera da progressione del paziente, indipendentemente dal livello di espressione di VDR nelle cellule del carcinoma.
La regolazione da parte di 1,25(OH)₂D₃ delle molecole di segnalazione (citochine, fattori di crescita) secrete dai CAF suggerisce che la D₃ potrebbe anche influenzare in modo paracrino la biologia delle cellule del carcinoma e delle cellule nel microambiente tumorale (cellule immunitarie ed endoteliali). In linea con questa ipotesi è stato trovato che la D₃ diminuisce la quantità di microRNA trovata negli esosomi secreti dai CAF pancreatici umani, il che attenua gli effetti promigratori e pro-invasivi che questi CAF esercitano sulle cellule del carcinoma pancreatico. Questi risultati mostrano che l’azione di 1,25(OH)₂D₃ si estende ai fibroblasti stromali tumorali e che 1,25(OH)₂D₃ è un importante regolatore della differenziazione CAF. I risultati degli studi disponibili quindi suggeriscono effetti anti-infiammatori e anti-angiogenici di 1,25(OH)₂D₃ a livello di cellule immunitarie ed endoteliali nel microambiente tumorale, e ampliano l’azione di pro-differenziazione di 1,25(OH)₂D₃ alle cellule del microambiente tumorale, il che può avere importanti conseguenze sullo sviluppo del cancro.
Effetti di 1,25(OH)₂D₃ sulle cellule staminali cancerose. Secondo il concetto di cellule staminali cancerose i tumori vengono avviati, progrediscono a causa dell’accumulo di alterazioni genetiche ed epigenetiche nelle cellule staminali tissutali che diventano cellule staminali cancerose (CSC). Ciò ha portato a indagini focalizzate sull’identificazione di marcatori di cellule staminali indifferenziate per isolare e colpire specificamente le CSC con farmaci o anticorpi appropriati. Tuttavia, i ricercatori si sono scontrati con la scoperta della plasticità delle cellule staminali. La staminalità è oggi considerata uno stato cellulare solitamente transitorio che si perde nel processo di differenziazione ma si riacquista quando il serbatoio delle cellule staminali deve essere rigenerato. Di conseguenza, non sembrano esistere CSC stabili all’interno dei tumori che possano essere isolate e studiate come target ottimali per le terapie antitumorali. Diversi studi hanno riportato che gli analoghi sintetici della D3 la formazione di sferoidi, o mammosfere (una caratteristica attribuita alle CSC) nelle cellule staminali del cancro al seno ottenute da linee cellulari stabilite, riduce l’espressione dei marcatori di staminalità, ha impoverito la sottopopolazione di cellule staminali cancerose presenti in una linea cellulare di cancro ovarico umano. Studi su organoidi, strutture tridimensionali generate da biopsie di tessuto sano e tumorale ottenute da pazienti con cancro del colon mostrano che 1,25(OH)₂D₃ induce la differenziazione cellulare negli organoidi tumorali, modificando il loro tipico aspetto di cellule blastiche in un fenotipo differenziato epiteliale. L’analisi globale dell’RNA trascrittomico ha rivelato che la D₃ promuove negli organoidi tumorali del colon e del retto la repressione dei geni coinvolti nella proliferazione e nella tumorigenesi. Negli organoidi normali del colon e del retto, derivati da tessuto sano, la D₃ sovraregola diversi geni chiave di staminalità e non influenza il fenotipo cellulare indifferenziato, regola negativamente i geni di differenziazione. Questo indica un’azione omeostatica di 1,25(OH)₂D₃ sulla popolazione di cellule staminali normali in entrambe le aree intestinali (colon e retto). Altri studi concordano con questi risultati, indicano cioè un’attività differenziale su cellule sane e su cellule tumorali: la D₃ esercita un’azione omeostatica nelle cellule staminali normali del colon ma un effetto prodifferenziante sulle CSC del colon.
Conclusioni. Il metabolita attivo della vitamina D, il 1,25(OH)₂D₃ e altri analoghi sintetici sono agenti di differenziazione che impongono uno stato epiteliale nelle cellule del carcinoma, in gran parte attraverso l’induzione di proteine epiteliali chiave e l’inibizione dell’EMT. Il lavoro svolto prevalentemente sul cancro del colon e del seno mostra che l’inibizione dell’EMT è principalmente una conseguenza dell’antagonismo che queste molecole esercitano sulle vie di segnalazione Wnt/β-catenina, TGF-β ed EGF. Inoltre, 1,25(OH)₂D₃ modifica profondamente il profilo di espressione genica dei fibroblasti stromali tumorali. Attenua il loro fenotipo attivato e diminuisce i loro effetti protumorali. Esercita anche azioni di prodifferenziazione sulle cellule staminali del cancro. Nel complesso, questi dati indicano che 1,25(OH)₂D₃, o gli analoghi, sono candidati per strategie di differenziazione del cancro.