Risultati indagini in vitro
SVCT-2 determina la suscettibilità differenziale alla morte cellulare indotta da VC farmacologica
Cinque linee cellulari di HCC umano e due linee di cellule epatiche immortalate sono state studiate trattandole con concentrazioni di VC comprese tra 0,3 e 1,5  mM.
I risultati osservati sono:
1) drastica diminuzione della vitalità delle cellule HCC in modo dose-dipendente;
2) citotossicità delle VC debole per le cellule epatiche immortalate;
3) per tutte le linee cellulari HCC, le concentrazioni di VC che determinano a una diminuzione del 50% della sopravvivenza cellulare (valori IC50) sono inferiori a 1 mM, ma con differenze tra le varie linee cellulari. La IC50 era più alta nelle linee cellulari immortalate.

Per indagare se la differenza nella suscettibilità al VC deriva da diversi flussi di VC nelle cellule, le espressioni di SVCT-1 e SVCT-2, sono state esaminate. I risultati osservati sono:
1) sia i livelli di mRNA che i livelli proteici di SVCT-2 erano inversamente correlati con i valori IC50 di VC nelle cellule testate. Quindi più alti è la presenza di SVCT-2, più bassa è la IC50, minore vitamina C serve per diminuire del 50% la sopravvivenza cellulare;
2) l’espressione di SVCT-1 è irrilevanti per i valori IC50;
3) i livelli di espressione di SVCT-2 sono correlati positivamente con le concentrazioni di VC all’interno delle cellule testate dopo il trattamento con VC. Maggiore è l’espressione di SVCT-2 maggiore è la quantità di VC che entra nelle cellule.

Per esplorare ulteriormente il ruolo di SVCT-2, il gene per SVCT-2 è stato silenziato tramite RNA corto a forcina (shRNA) e vettore lentivirale. È stato osservato:
1) aumento della vitalità della cellule anche dopo il trattamento con VC, indicando resistenza alla VC;
2) il flusso di VC nelle cellule è diminuito drasticamente.

La sensibilità differenziale alla VC deriva da variazioni nel flusso di VC nelle cellule, che dipende dall’espressione di SVCT-2.

La VC farmacologica uccide preferenzialmente le CSC epatiche in vitro
Considerato che le CSC epatiche mostrano un arricchimento di SVCT-2 è stato indagato se le CSC epatiche fossero più sensibili alla morte cellulare indotta da VC. Il trattamento con VC ha:
1) marcatamente sottoregolato le espressioni dei geni correlati alla staminalità;
2) ridotto la percentuale di cellule positive a marcatori di staminalità sia nelle cellule CSC di HCC che nelle sfere tumorali;
3) compromesso significativamente la capacità delle CSC di formare sferoidi tumorali, di accrescerli.

In contrasto con il cisplatino, al quale le CSC resistono, il trattamento con VC ha marcatamente sottoregolato la staminalità delle CSC.

Morte cellulare farmacologica indotta da VC dipendente da SVCT-2
Vari meccanismi di induzione alla morte cellulare da VC sono stati presi in considerazione.

Produzione di radicali liberi. I livelli intracellulari di specie reattive dell’ossigeno (ROS) sono aumentati in linee cellulari di HCC che esprimono in modo differenziale la proteina SVCT-2 dopo l’esposizione a VC. È stato rilevata una maggiore produzione di ROS nelle cellule con un’espressione SVCT-2 relativamente più elevata. L’antiossidante, N-acetil-L-cisteina (NAC), che previene la produzione di ROS indotta da VC (uno scavenger di ROS), ripristina completamente la vitalità e la formazione di colonie tra le cellule trattate con VC.
Danno al DNA. In seguito al trattamento con VC è stato riscontrato un danno al doppio filamento del DNA, dose dipendente. Il trattamento con H₂O₂ (una forma principale di ROS) da effetti simili al trattamento con VC. Il danno al DNA è stato prevenuto da NAC. La riduzione del danno è stata osservata in cellule con il silenziamento di SVCT-2. Il farmaco Olaparib, un inibitore della riparazione del DNA ha aumentato significativamente la morte cellulare indotta da VC.
Deplezione di ATP. Un eccessivo stress ossidativo causa l’esaurimento dell’adenosina trifosfato cellulare (ATP). Diminuzioni di ATP dipendenti dal tempo sono state osservate nelle cellule HCC trattate con VC e la riduzione dei livelli di ATP era maggiore nelle cellule che esprimevano maggiormente SVCT-2. Questo effetto del trattamento con VC è stato drasticamente invertito da: 1) NAC suggerendo il ruolo dei ROS nel ridurre i livelli di ATP; 2) il silenziamento SVCT-2.
Blocco del ciclo cellulare. Il trattamento con VC ha indotto l’arresto del ciclo cellulare in fase G2/M, e una significativa riduzione delle fasi G0/G1, una maggiore espressione dell’inibitore della divisione cellulare, in modo dipendente dalla concentrazione. Inoltre, è stato rilevato un caratteristico picco del contenuto di DNA ipodiploide tipico di cellule apoptotiche, indicando l’induzione di apoptosi dopo l’arresto G2/M. Risultati simili si ottengono trattando le cellule con H₂O₂. Al contrario, il trattamento con il NAC invece ha inibito l’arresto del ciclo cellulare innescato da VC.

Complessivamente, questi dati indicano che l’afflusso di VC nelle cellule tramite SVCT-2 aumenta i livelli di ROS intracellulari, che inducono danno al DNA e deplezione di ATP, portando alla morte cellulare parzialmente tramite arresto del ciclo cellulare e apoptosi.

Risultati indagini in vivo
La VC farmacologica compromette la crescita del tumore e sradica le CSC epatiche in vivo
Per studiare gli effetti della VC farmacologica in vivo, sono stati preparati modelli di xenotrapianti di cellule HCC e modelli di xenotrapianti derivati da pazienti HCC (PDX). Coerentemente con i risultati in vitro, il trattamento con VC ha:
1) ridotto le espressioni dei geni correlati alla staminalità. La sola terapia convenzionale con cisplatino ha portato all’aumento delle CSC. La combinazione di VC e cisplatino è stata più efficace nel ridurre la crescita e il peso del tumore.
2) Nei modelli di xenotrapianti con tessuti da pazienti (PDX) di HCC con espressione SVCT-2 relativa bassa e alta, il trattamento con VC ha ritardato significativamente la crescita del tumore.

3) In modelli di xenotrapianti da pazienti che avevano un’espressione SVCT-2 relativamente più elevata, mostravano una crescita e una massa tumorale inferiori rispetto a quelli con espressione del trasportatore minore, suggerendo un’ipersensibilità verso il trattamento VC.
4) i livelli di espressione dei geni associati alle CSC e le percentuali di CSC nei PDX sono diminuiti drasticamente dopo il trattamento con VC, confermando il ruolo inibitorio di VC nelle CSC epatiche.

Il trattamento con VC inibisce la crescita del tumore nei modelli HCC PDX e il livello di espressione di SVCT-2 è associato alla risposta al trattamento con VC.

La VC endovenosa riduce il rischio di progressione dell’HCC post-chirurgico
Sono stati arruolati seicentotredici pazienti con HCC che hanno ricevuto una resezione epatica curativa e divisi in due gruppi: utenti VC e utenti non VC. Il 55,3% del pazienti ha ricevuto 2 g di VC per via endovenosa per 4 o più giorni dopo l’epatectomia iniziale. La sopravvivenza libera da malattia (DFS) a 5 anni per i pazienti che hanno ricevuto VC per via endovenosa è stata del 24%, rispetto al 15% per i pazienti non trattati con VC. Il tempo di sopravvivenza libera da malattia mediano per i pazienti trattati con VC è stato di 25,2 rispetto a 18 mesi per i non trattati coni VC. Questi risultati suggeriscono che l’uso di VC per via endovenosa è collegato a un miglioramento della sopravvivenza libera da malattia.

Discussione
La VC farmacologica ha suscitato un crescente interesse nel campo della terapia del cancro. Pochi studi hanno valutato l’effetto della VC sulle cellule staminali del cancro (CSC). In questo studio, su CSC epatiche che hanno un’elevata espressione di SVCT-2, concentrazioni clinicamente ottenibili di VC hanno preferenzialmente sradicato le CSC epatiche in vitro e in vivo. Inoltre, con uno studio di coorte retrospettivo è stato evidenziato che la VC per via endovenosa ha ridotto il rischio di progressione dell’HCC post-chirurgica.

Essendo la proteina chiave responsabile dell’assorbimento di VC, SVCT-2 svolge un ruolo cruciale nel regolare la sensibilità alla citotossicità indotta dall’ascorbato.

a) Maggiori espressioni di SVCT-2 sono correlate negativamente alla quantità di VC necessaria per ridurre del 50% la crescita celluare, e positivamente con la quantità di VC nelle cellule HCC dopo il trattamento con VC.

b) Il silenziamento di SVCT-2 in cellule altamente sensibili, ha ridotto drasticamente la loro sensibilità alla VC.

c) SVCT-2 è altamente espresso nei campioni di HCC umano e particolarmente elevato nelle CSC epatiche. L’abbattimento dell’espressione di SVCT-2 ha influenzato significativamente l’autorinnovamento, la chemioresistenza e la tumorigenicità delle CSC epatiche.

La VC si distingue da altri farmaci chemioterapici ben definiti (ad esempio, cisplatino, doxorubicina) in quanto non determina l’arricchimento delle CSC, non determinando resistenza. Al contrario, è stato rivelato che il trattamento con VC riduce drasticamente la capacità di autorinnovamento di queste cellule, i livelli di espressione dei geni legati alla staminalità e le percentuali di CSC nell’HCC, indicando che le CSC erano più suscettibili alla morte cellulare indotta da VC. Pertanto, come farmaco per l’eradicazione delle CSC, la VC può rappresentare una strategia promettente per il trattamento dell’HCC, da solo o in combinazione con farmaci chemioterapici. Per quanto riguarda i meccanismi d’azione, questo studio nell’HCC, ha evidenziato che le specie reattive dell’ossigeno (ROS) generati da VC causavano stress genotossico (danno al DNA) e stress metabolico (deplezione di ATP), che portando all’arresto del ciclo cellulare e all’apoptosi.

Nel loro insieme, i risultati di questo studio svelano la potenziale applicazione della VC per la terapia dell’HCC.